南方水稻黑条矮缩病测报技术规范

南方水稻黑条矮缩病测报技术规范

1范围

本标准规定了南方水稻黑条矮缩病测报调查的病毒检测技术、病情调查方法，以及调查数据记载归档的要求。

本标准适用于农业植保部门南方水稻黑条矮缩病测报调查, 有关研究及生产单位可参考执行。

2术语与定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1 

南方水稻黑条矮缩病毒 Southern rice black-streaked dwarf virus (以下简称SRBSDV)

 属斐济病毒属（Fijivirus），病毒粒体球状，直径70～75 nm，病毒基因组由10片段dsRNAs组成。该病毒可在传毒介体白背飞虱体内增殖，循回期（从获毒至可传毒的间隔时间）5d～7d，最短传毒取食时间为5min～10min。

2.2 

传毒介体 transmission vector

携带可以侵染水稻的SRBSDV的昆虫。SRBSDV的传毒介体为白背飞虱 (Sogatella furcifera Horváth, white-backed planthopper，以下简称WBPH)，属昆虫纲同翅目飞虱科。成虫与若虫皆能传毒，且若虫传毒效率高于成虫，但不经卵传毒。

2.3  

传毒方式 virus transmission manner

白背飞虱传播SRBSDV的方式为持久性传毒，又称循回型传毒或增殖型传毒。白背飞虱在毒源植物上经较长时间吸食获得病毒，经数小时或更长时间的循回期后即可传毒。获毒后，白背飞虱持毒期长，终身带毒。

2.4  

带毒率 rate of viruliferous WBPH

携带SRBSDV的白背飞虱虫量占白背飞虱调查总虫量的百分率。

2.5  

显症 symptomatic appearance

水稻感染SRBSDV一段时间后表现出植株矮缩、倒生根、纵向排列的小瘤突等症状，一般感染15d左右达显症高峰。

2.6

病丛（株）率 diseased cluster (plant) rate

     发病水稻丛（株）数占调查总丛（株）数的百分率。

2.7

见病面积 diseased occurrence area

指田间出现南方水稻黑条矮缩病的田块面积总和。

2.8

发生面积 diseased epidemic area

指田间南方水稻黑条矮缩病实际发生病丛率大于1%的田块面积总和。

3  白背飞虱带毒率调查检测

3.1 带毒率测定方法

采用dot-ELISA检测试剂盒或采用商品化PCR试剂盒测定白背飞虱的带毒率情况。每批次检测白背飞虱数量应在100头以上（如果1次采虫不足100头，可采用连续几天收集或采集的虫体标本进行检测）。然后逐个检查反应类型（带毒白背飞虱呈现阳性反应），记载带毒虫量。根据公式（1）计算带毒率。

通过公式（1）计算带毒率。

     ……………………………………………………………………（1）

式中：

H ——带毒率，单位为百分率（%）；

S ——带毒虫量，单位为头；

Z ——检测总虫量，单位为头。

3.2  越冬白背飞虱虫口密度调查及带毒率检测

3.2.1  调查时间：每年2月中旬至翻耕前调查1次，各地每年调查时间应大致相同。

3.2.2  调查地点：白背飞虱常年可越冬区域或间歇越冬区域（广东、广西、福建、云南、海南）。

3.2.3  调查方法：在冬种稻、再生稻苗、落谷苗、稻桩、田边和沟边杂草（游草）等越冬场所调查，用网扫法（针对成、若虫）,每点扫10复网次（左右摆幅3 m，总共30㎡以上）。若收集到的白背飞虱少于50头，则检测所有白背飞虱，计算带毒率；若多于50头，则检测50头白背飞虱，计算带毒率。检测结果填入表A.1并及时上报。

3.3  灯下白背飞虱带毒率调查检测

3.3.1 调查时间：分早、中、晚稻，在每季水稻秧苗期至分蘖期，逐日收集白背飞虱，每周集中检测1次；如遇白背飞虱集中迁入峰，则单独检测峰日白背飞虱。

3.3.2  调查地点：南方水稻黑条矮缩病发生省份或可能发生省份。

3.3.3  调查方法：采用自动虫情测报灯，逐日收集白背飞虱，将每日白背飞虱样品置于1.5 mL尖底或2 mL平底小离心管中。为防止虫体腐烂，管内再放入适量经70%酒精浸润的纸巾或棉球,盖紧管盖。管壁标明地点和日期，初处理后及时进行检测。如灯下监测出现白背飞虱明显迁入峰，则需要对迁入峰日的白背飞虱带毒情况进行单独检测。检测结果填入表A.2、表A.3并及时上报。

4  水稻田间发病情况调查

4.1  系统调查

4.1.1  调查时间：自白背飞虱迁入高峰后，每10天调查1次（可结合白背飞虱虫量调查同时进行），至水稻蜡熟期结束。

4.1.2  调查地点：水稻本田期，在白背飞虱带毒虫量高、常年南方水稻黑条矮缩病发病比较重、有代表性的地区，选取不同抗感病品种、不同播栽期的类型田各1块，作为系统观测圃。

4.1.3  调查方法：采用平行跳跃10点取样，每点查20丛，记载发病丛数、病株数，根据公式（2）分别计算病丛率、病株率。结果记入表A.4。

通过公式（2）计算病丛（株）率：

 …………………………………………………………（2）

I  ——病丛（株）率，单位为百分率（%）；

P_i ——病丛（株）数；

P_m ——调查总丛（株）数。

4.2 病情普查

4.2.1  调查时间：根据水稻不同播期与抗性，分别选择早、中、晚及不同抗感类型田各3～5块，于双季早稻、中稻及双季晚稻的分蘖末期和齐穗期各调查1次。

4.2.2  调查地点：南方水稻黑条矮缩病发生省份或可能发生省份。

4.2.3  调查方法：在观察区和辖区范围内调查每种主要水稻类型田不少于20块，面积不少于1 hm²，可结合白背飞虱大田普查同时进行。采用平行跳跃10点取样，本田每点调查20丛。记录调查情况，并进行带毒率检测（记载发病田块数、发病丛数，计算病田率、病丛率）。每季水稻病情稳定后，根据各生育期发病普查结果，统计水稻种植及南方水稻黑条矮缩病见病、发生、防治面积。调查结果填入表A.5和表A.6并及时上报。

5 数据报送和传输

5.1  模式报表

按统一汇报格式、时间和内容汇总上报（见附录B）。其中，发生程度分别用1、2、3、4、5表示。同历年比较的早、增、多、高用“＋”表示，晚（迟）、减、少、低用“－”表示；与历年相同和相近，用“0”表示；缺测项目用“××”表示。

5.2  信息共享平台

全国农作物重大病虫害数字化监测预警系统南方水稻黑条矮缩病发生与监测信息共享平台，登录地址：http://202.127.42.217。

6  调查资料表册

全国制定统一的“调查资料表册”（样表见附录A），其中的内容不能随意更改，各项调查内容须在调查结束时，认真统计和填写。3.1中采用dot-ELISA检测试剂盒测定白背飞虱的带毒率情况的方法参见附录C，4.1.3中病丛、病株的分级指标参见附录D。

7        预测预报方法

南方水稻黑条矮缩病由迁飞性害虫白背飞虱传播，其发生为害与白背飞虱的虫源基数和带毒率、耕作制度、气候条件、白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度等密切相关。预测预报可根据南方水稻黑条矮缩病田间发病丛数调查结果，结合白背飞虱的虫源基数和带毒率、耕作制度、气候条件、白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度等因素综合分析，作出南方水稻黑条矮缩病发生程度趋势预报（参考附录C）。

7.1 虫源基数和带毒率

南方水稻黑条矮缩病毒主要由白背飞虱携带传播，白背飞虱一旦获毒可终身带毒，若虫、成虫均能传毒，且传毒效率非常高，但不经卵传毒。带毒白背飞虱通过吸食传毒为害。南方水稻黑条矮缩病发生流行主要取决于白背飞虱种群数量及其带毒率高低。带毒率高，种群数量大，有利于病害发生流行。

7.2  耕作制度

  田间稻作复杂、杂草多，有利于带毒白背飞虱的辗转传毒为害；调查研究结果表明，育秧移栽田重于直播田；杂交稻重于常规稻；水稻混栽区重于连片稻作区；田块间发病程度差异显著；中、晚稻发病重于早稻等。

7.3  气候条件

  冬季气温偏高有利于白背飞虱越冬和其北界向高纬度延伸，扩大越冬范围和越冬虫源数量，增加毒源积累。春季强对流天气多，多雨有利于大量的南方越冬区白背飞虱随气流北迁。特别是5～8月份强降雨天气增多，迁入的白背飞虱虫量大，如果带毒率高，极有利于南方水稻黑条矮缩病发生流行，病害有可能加重流行。

7.4  白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度

水稻秧苗期至分蘖前期对南方水稻黑条矮缩病毒的抵抗力比较差，为南方水稻黑条矮缩病侵入敏感期，若此期间遇上白背飞虱迁入峰（且白背飞虱带毒），极有利于病毒侵染发病。

附录Ａ

（规范性附录）

农作物病虫调查资料表册

表A.1  白背飞虱越冬带毒情况调查

调查地点：         省       县(市、区)站

表A.2  灯下白背飞虱带毒情况调查

调查地点：         省       县(市、区)站

表A.3  灯下高峰日白背飞虱带毒情况调查

调查地点：         省       县(市、区)站

表A.4  南方水稻黑条矮缩病田间发病系统调查表

调查地点：         省       县(市、区)站

表A.5  南方水稻黑条矮缩病田间病情普查表

调查地点：         省       县(市、区)站

表A.6  南方水稻黑条矮缩病发生基本情况

调查地点：         省       县(市、区)站

附录B

（规范性附录）

南方水稻黑条矮缩病模式报表

表B.1 越冬代白背飞虱南方水稻黑条矮缩病毒带毒率检测模式报表

注：此表由白背飞虱越冬区各区域站在3月30日前调查汇报1次。

表B.2 灯诱白背飞虱南方水稻黑条矮缩病毒带毒率检测模式报表

注：此表在5月5日、6月5日、7月5日、8月5日前调查上报。

表B.3 南方水稻黑条矮缩病田间发生情况系统调查模式报表

注：此表自田间见病后每月逢1日调查汇报1次。

表B.4 南方水稻黑条矮缩病田间发生情况普查模式报表

注：此表于每季水稻发病稳定后调查汇报1次（早稻6月10日、中稻7月30日、晚稻9月20日）。

 附录C

（规范性附录）

南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）dot-ELISA检测方法

1  试验原理

dot-ELISA是以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体的ELISA检测方法，具有简便、快速、特异、敏感、便于推广、不需特殊仪器等优点，目前在人类、动植物病原检测中广泛应用。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱（或水稻植株）样品的匀浆液点到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗南方水稻黑条矮缩病毒的鼠单抗，则单抗与固相抗原（SRBSDV）形成抗原-抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶（HRP）[检测植株时加入碱性磷酸酶（AP）]标记的抗鼠IgG抗抗体（即二抗），则抗抗体与上述抗原-抗体复合物结合形成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物；加入显色底物，复合物上的酶催化底物生成沉淀型有色产物而显色。由于每步之间均有洗涤的步骤，若待测白背飞虱（水稻植株）样品中不含SRBSDV，则酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。肉眼观察斑点颜色有无及深浅来进行样品中SRBSDV的定性和半定量检测。

2 白背飞虱样品检测

2.1  主要试剂与材料准备

0.01 mol/L PBS                                       10 mL

SRBSDV单克隆抗体                                    0.1 mL

HRP标记羊抗鼠IgG二抗                              0.04 mL

TMB显色底物液                                         4 mL

10×浓缩封闭液                                         5 mL

10×抗体稀释液                                         5 mL

20×浓缩洗涤液                                        10 mL

以上试剂均保存于4℃下

NC膜                                                  2张

2.2  操作步骤

（1）一头白背飞虱放入1.5 mL的离心管中后加入50～200 μl 0.01 mol/L PBS，用牙签或200 μl枪头捣碎飞虱；

（2） 5000 rpm离心3 min，如无条件此步可以省略;

（3） 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，室温干燥10～20 min;

（4） NC膜浸入到封闭液中室温封闭30 min;

（5） NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min;

（6） 水平摇床上用洗涤液洗膜3～4次，每次3 min;

（7） NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

（8） 水平摇床上用洗涤液洗膜4～5次，每次3 min;

（9） 将TMB底物显色液滴加到膜表面进行显色反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录检测结果。

2.3  缓冲液配方

（1）磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, KH₂PO₄ 0.2 g, Na₂HPO₄•12H₂O 3 g，加蒸馏水950 mL溶解后调pH至7.4，定容至1000 mL。

（2）封闭液：用去离子水将10×封闭液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的封闭液在4℃环境可保存一个月。

（3）洗涤液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水），稀释后的洗涤液在4℃环境可保存一个月。

（4）抗体稀释液：用去离子水将10×抗体稀释液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的抗体稀释液在4℃环境可保存一个月。

2.4  注意事项

(1)硝酸纤维素膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子和戴一次性PE手套取膜；

(2)NC膜CK+处为阳性对照（点带SRBSDV的白背飞虱匀浆液）；

(3)NC膜CK-处为阴性对照（点无SRBSDV的白背飞虱匀浆液）；

(4)NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；

(5)抗体在使用前10 min之内稀释;

(6)阳性对照和阴性对照来自于带毒和非带毒的白背飞虱，仅用于dot-ELISA检测；

(7)该试剂盒反应温度为4～38℃，最佳反应温度为37℃。

2.5  贮藏条件及保存期

试剂盒于2～8℃避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。

3  水稻植株样品检测

3.1  主要试剂与材料

0.01 mol/L PBS                                          10 mL

SRBSDV单克隆抗体                                      0.1 mL

AP标记羊抗鼠IgG二抗                                 0.04 mL

10×浓缩封闭液                                           5 mL

10×抗体稀释液                                           5 mL

20×浓缩洗涤液                                          20 mL

NBT储备液                                             0.15 mL

BCIP储备液                                             0.1 mL

底物缓冲液                                               20 mL

以上试剂均保存于4℃下

NC膜                                                     2张

3.2  操作步骤

（1） 水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（重量：体积，克/毫升）加入0.01 mol/L PBS后研磨；

（2） 5000 rpm离心3 min;

（3） 去2 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，室温干燥10～20 min;

（4） NC膜浸入到封闭液中室温封闭30 min;

（5） NC膜放入用封闭液1：1000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min;

（6） 水平摇床上用洗涤液洗膜3～4次，每次3 min;

（7） NC膜放入用封闭液1：1000倍稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

（8） 水平摇床上用洗涤液洗膜4～5次，每次3 min;

（9） 66 μl NBT和33 μl BCIP底物加到10 mL底物缓冲液中混匀，洗好的膜放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录结果。

3.3  缓冲液配方

（1）磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, KH₂PO₄ 0.2 g, Na₂HPO₄•12H₂O 3g，加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 mL。

（2）封闭液：用去离子水将10×封闭液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的封闭液在4℃环境可保存一个月。

（3）洗涤液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水），稀释后的洗涤液在4℃环境可保存一个月。

（4）抗体稀释液：用去离子水将10×抗体稀释液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的抗体稀释液在4℃环境可保存一个月。

（5）底物显色液：66 μL NBT和33 μL BCIP加到10 mL的底物缓冲液混匀。

3.4  注意事项

（1）NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子和戴一次性PE手套取膜；

（2）NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；

（3）硝酸纤维素膜CK+处为阳性对照（点含SRBSDV病毒的水稻叶片汁液）；

（4）硝酸纤维素膜CK-处为阴性对照（点健康水稻叶片汁液）；

（5）抗体在使用前10 min之内稀释；

（6）底物显色液要现配现用；

（7）阳性对照和阴性对照来自于水稻病叶，仅用于dot-ELISA检测；

（8）该试剂盒反应温度为4～38℃，最佳反应温度为37℃。

3.5  贮藏条件及保存期

试剂盒于2～8℃避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。

附录D

（资料性附录）

南方水稻黑条矮缩病病情划分指标

表D.1 南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级指标

表D.2  南方水稻黑条矮缩病发生程度分级指标