高致病性H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法

高致病性H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法

1　范围

本方法规定了检测H7亚型动物流感病毒核酸的TaqMan荧光RT-PCR操作程序。

本方法适用于高致病性H7亚型动物流感病毒核酸的快速检测和定型。

2　规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682  分析实验室用水规格和实验方法。

GB/T 27401  实验室质量控制规范 动物检疫。

GB 19489  实验室生物安全通用要求。

GB/T18936-003  高致病性禽流感诊断技术。

GB/T 19438.1  禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法

3　缩略语

荧光RT-PCR  实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）

HA          血凝素（Hemagglutinin）

FAM         羧基荧光素（Carboxyfluorescein ）

DEPC        焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）

Ct/Cp值      每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数

            （Threshold Cycle /Crossing Point）

4　原理

2013年3月底我国发生人感染H7N9流感病毒的公共卫生事件，这也是世界上首次发现H7N9亚型流感病毒能够感染人。本方法结合H7N9变异情况，在对序列比对的基础上，设计一对引物和一条FAM荧光素标记的探针，建立了能够检测高致病性H7亚型流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。

5　试剂和材料

5.1　试剂

5.1.1　总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。

5.1.2　DEPC水：见附录A.1。

5.1.3　无水乙醇。

5.1.4　PBS（含青霉素和链霉素）：配方见附录A.2。

5.1.5　H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液配方见附录B。

5.1.6　阴性、阳性对照

——阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。

——阳性对照为β-丙内酯灭活（灭活72 h）的高致病性H7N9亚型流感病毒胚尿囊液培养物。

5.1.7　Carrier RNA工作液的准备  

裂解液在使用前需要按比例添加Carrier RNA，配制好后在2~保存最多48h，（因此裂解液必须现用现配）。配制方法见下表。

Carrier RNA工作液配制表

注意：请将裂解液与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现气泡，请勿使用漩涡震荡。Carrier RNA的使用对于有效回收两种病毒核酸是重要的。首先，Carrier RNA促进病毒核酸与二氧化硅膜的结合，特别是当样品中仅存在少量病毒核酸分子时；另外，当存在少量活性RNA酶分子的情况下，Carrier RNA能降低病毒RNA被降解的可能性。如果不向裂解溶液中加入载体RNA，可能导致病毒核酸收集量下降。

5.1.8　向缓冲液GD中加入无水乙醇。

5.2　仪器设备

5.2.1　荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。

5.2.2　高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12 000 r/min）。

5.2.3　台式离心机。

5.2.4　振荡器。

5.2.5　组织匀浆器。

5.2.6　冰箱（2 ℃～和两种）。

5.2.7　微量移液器（，，，1）及配套吸头。

5.2.8　1.5 mL 离心管（无核酸酶）和5 mL采样管。。

6　样品的采集与前处理

6.1　总则

尽量使用新鲜的样品材料。采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套，注意无菌操作。

6.2　取样工具

6.2.1　采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、商品化一次性采样袋。

6.2.2　除采样袋外，上述取样工具必须经121℃±，15 min高压灭菌并烘干或经干烤2 h。

6.3　样品采集

6.3.1　拭子样品

根据动物种类可分别采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪）。采集方法如下：

——取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液；

——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并蘸取少量粪便；

——取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物；

将采样后的拭子分别放入盛有1.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号。

6.3.2　肌肉或脏器样品

用无菌剪、镊采集待检脏器或肌肉组织，装入无菌采样袋或其他灭菌容器，编号。

6.4　样品贮运

样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，24 h内送实验室。

6.5　样品处理

6.5.1　拭子样品

样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3 000 r/min离心5 min，吸取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。

6.5.2　肌肉或脏器组织

用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）混匀，3 000 r/min离心5 min后，取1.0 mL上清液转入无菌1.5 mL灭菌离心管中，编号备用。

6.6　样品存放

采集或处理好的样品在2 ℃～条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

7　荧光RT-PCR检测操作方法

7.1　实验室的标准化设置与生物安全管理

实验室设置与管理见GB/T 19438.1附录C。

7.2　样本核酸的提取

7.2.1　在样本制备区进行，采取柱式提取。也可采用经验证的其他商品化RNA提取试剂盒。

7.2.2　待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。

7.2.3　用移液器将20µL蛋白酶K加入n个灭菌1.5mL离心管中。

7.2.4　向离心管中加入200µL待处理样品（包括阳性对照、阴性对照），如果样品体积小于200µL，可加入PBS补齐。

7.2.5　加入200µL Carrier RNA工作液（裂解液与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法如表1，或按照公式计算）。盖上管盖，漩涡振荡15s。

7.2.6　在孵育15min。瞬时离心。

7.2.7　加入250µL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并漩涡振荡15s，在室温放置5min，瞬时离心。

7.2.8　仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至吸附柱，（8000 rpm）离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7.2.9　打开吸附柱盖，加入500µL缓冲液GD（请务必确认该试剂在用前加入无水乙醇），盖上吸附柱管盖，（8000rpm）离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7.2.10　重复步骤7.2.9一次。

7.2.11　（12000rpm）离心3min，使吸附柱的膜变干，弃废液。

7.2.12　将吸附柱放入一个干净的1.5mL RNase-Free离心管，打开吸附柱盖，向吸附柱的膜中央加入20µL DEPC水，盖上吸附柱的盖，室温放置1min。（12000rpm）离心1min，洗脱RNA待用。

7.2.13　提取的RNA尽快进行扩增，短期保存可在冰箱，若需长期保存须放置冰箱。

7.3　荧光RT-PCR扩增试剂的准备与配制

在反应混合物配制区进行。

每个检测反应体系需使用15μL荧光RT-PCR反应液。根据7.2.2中提到的n值，按附录B.2配制反应液，充分混匀后分装，每个反应管15 μL。转移反应管至样本制备区。

7.4　加样

在样本制备区进行。

在上述7.3的反应管中分别加入7.2.12中制备的RNA溶液5 μL，使每管总体积达到20 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，500 r/min离心30 s。

7.5　荧光RT-PCR反应

在检测区进行。

应使用能采集并区分FAM荧光信号的荧光PCR仪。

将7.4中加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内，编辑样品表后，选定FAM检测通道读取H7亚型流感病毒检测结果，淬灭基团选择none。之后如下设置反应参数：

——               第一阶段，反转录/15 min；

——               第二阶段，预变性/2 min；

——               第三阶段，/15 s，/60 s，40个循环，在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。     

试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct/Cp值判定结果。

8　结果判定

8.1　结果分析条件设定

阈值设定原则：综合分析仪器给出的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），使仪器给出正确的结果。

8.2　质控标准

8.2.1　阴性对照检测通道读取数据均无Ct/Cp值并且无特征性扩增曲线。

8.2.2　阳性对照检测通道读取数据出现特征性扩增曲线，且Ct/Cp值均应≤30。

8.2.3　如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

8.3　结果描述及判定

8.3.1　对于测定样品FAM通道Ct值≤30，报告高致病性H7亚型流感病毒核酸阳性；

8.3.2　对于测定样品FAM通道30＜Ct值≤35，报告高致病性H7亚型流感病毒核酸可疑，需要重新检测。若重新检测仍界于30＜Ct值≤35，且有特征性扩增曲线，可报告样品阳性，否则报告样品阴性；

8.3.3　对于测定样品FAM通道No Ct或Ct值＞35，报告高致病性H7亚型流感病毒核酸阴性。

附　录　A 

（规范性附录）

溶液配制

以下所用试剂均为分析纯。

A.1　DEPC水配方

将DEPC加入去离子水（符合GB6682要求）中至终浓度为0.1%（v/v），充分混合均匀后作用12 h，分装，121 ℃±高压灭菌30 min，冷却后冷藏备用。

A.2　磷酸盐缓冲液（PBS）配方（含青霉素和链霉素）

A.2.1　A液

0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH₂PO₄·H₂O，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。

A.2.2　B液

0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na₂HPO₄·7H₂O  ，（或Na₂HPO₄·12H₂O或Na₂HPO₄·2H₂O）加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.2.3　0.01 mol/L、pH7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）（含青霉素和链霉素 ）的配制

取A液14 mL， B液36 mL，加NaCl，用蒸馏水定容至1 000 mL。经±，15 min高压灭菌后，冷却后，无菌条件下分别按10 000 U/mL加入青霉素和链霉素。